猪伪狂犬病毒gB基因在大肠杆菌中的分段表达

猪伪狂犬病毒gB基因在大肠杆菌中的分段表达

包新奇黄绍华刘巧荣孙明杨璐申屠芬琴康立平陈西钊

江苏省疾病预防控制中心；

徐州市高校兽医站；

北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；

中国动物疫病预防控制中心

伪狂犬（Pseudorabies）又称奥捷士奇病（Aujeszky's，AD），是由伪狂犬病毒（pseudorabiesvirus，PRV）引起的包括多种病畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是该病的自然宿主和贮存者。可引起妊娠母猪的流产，产死胎和木乃伊胎，新生仔猪的大量死亡。自1902年发现以来，伪狂犬病已在全球范围内流行，给世界养猪业造成了巨大的经济损失，成为严重危害养猪业的重大传染病之一。该病毒属于疱疹病毒科A疱疹病毒亚科，为双股线形DNA，约150kb，编码70种～100种蛋白。目前已经鉴定了11种糖蛋白，其中gB（glycoproteinB）是最主要的保护性抗原之一，能刺激机体产生补体依赖性和补体非依赖性的中和抗体以及病毒特异性的细胞免疫应答反应。

gB基因在疱疹病毒成员中属于最保守的糖蛋白基因，在不同的疱疹病毒之间，gB蛋白的功能可以相互取代。其大小约2.8kb，编码913个氨基酸。拥有一段信号肽系列（N端的58个氨基酸）。成熟的gB蛋白C端有3个疏水区，其中最后一个疏水区为跨膜区（740aa～808aa）。gB以二硫化物连接的三聚糖蛋白复合体的形式存在，即gBa，gBb和gBc，大小分别为855aa（59aa～913aa）、444aa（59aa～502aa）和411aa（503aa～913aa）。gBb和gBc是gBa剪切后的产物。gB蛋白有多个抗原决定簇，其中59～126之间有3个连续的抗原决定簇，在214aa～279aa之间有一个连续的抗原决定簇，在540aa～734aa区间有8个潜在的非连续抗原决定簇，其中有两个位点位于540aa～646aa之间。根据gB的以上特点，本研究将PRV的gB基因分4个片段进行表达和鉴定，为研制猪伪狂犬病gB抗体检测试剂盒奠定基础。

1材料和方法

1.1毒株与血清

伪狂犬病毒毒株为新疆分离株，由中国动物疫病预防控制中心提供。感染伪狂犬病毒的阳性血清、阴性血清、22份猪血清临床样品均为本试验室保存。

1.2载体、菌株、试剂

pGEM-T-easy、内切酶EcoRI和SalI购自Promega公司。pGEX-6P-1表达载体购自AmershamPharmacia公司。大肠杆菌BL21感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。氨苄青霉素、辣根过氧化酶标记的抗猪IgG购自Sigma公司。病毒DNA提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自Omega公司。gB-ELISA试剂盒购自IDEXX公司。

1.3引物设计与合成

依据发表的gB序列（序列号:A68929），分别在氨基酸位置59aa～502aa，39aa～155aa、368aa～575aa和540aa～740aa设计4对引物，上、下游引物分别加EcoRⅠ、SalⅠ酶切位点。

gB-1:PRV-Bb-F:5'-ATAGAATTCATGGCGGCCGTGACGCGG-3'

PRV-Bb-R:5'-ATTGTCGACTTAGCGCCGGGCCCGACGGGC-3'

gB-3:PRV-59-F:5'-ATAGAATTCATGGCGGCCGTGACGCGG-3'

PRV-59-R:5'-TTTGTCGACTTAGAAGGAGTCGTAGGGGTAC-3'

gB-4:PRV-368-F:5'-ATAGAATTCATGCCCAAGACGCGGCGCGT-3'

PRV-368-R:5'-TTTGTCGACTTAGCTGGGGTTCAGGCGCGACA-3'

gB-5:PRV-540-F:5'-ATAGAATTCATGATCCAGGCGCACGTGAAC-3'

PRV-540-R:5'-TTTGTCGACTTAGTAGAACTTGAGCGCGTGCA-3'

4对引物分别可扩增大小为1332bp、714bp、624bp和603bp的片段。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.4扩增及克隆

1.4.1病毒DNA的提取

参照Omega公司的病毒DNA提取试剂盒操作说明提取PRV总DNA。

1.4.2PCR扩增

程序为95℃3min，94℃45s，72℃～52℃60s，72℃90s，40个循环后，72℃延伸10min。

1.4.3PCR产物电泳、克隆和序列测定

PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，用Omega公司胶回收试剂盒回收PCR产物，克隆到pGEM-T-easy，经PCR鉴定阳性的重组质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.5重组表达质粒的构建

将阳性质粒用EcoRI和SalI进行双酶切，回收gB各片段，连接至经同样双酶切的原核表达载体pGEX-6P-1中，构建原核重组表达质粒pGEX-6pgB-1、pGEX-6p-gB-3\pGEX-6p-gB-4和pGEX-6p-gB-5。转化至BL21感受态细胞。筛选阳性克隆，提取质粒，用EcoRI和SalI酶切鉴定，鉴定正确的阳性质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.6诱导表达、纯化及鉴定

阳性单菌接种于LB/AMP培养液中，当菌摇至OD600=0.6～0.8时，加入终浓度为1mM/L的IPTG诱导4h，收菌。菌体超声破碎，4℃10000r离心10min，收集上清和沉淀。用电洗脱的方法进行重组蛋白纯化，按照文献的方法进行SDS-PAGE和Westernblotting鉴定，同时进行薄层扫描分析目的蛋白的表达情况。

1.7ELISA

间接ELISA：以3种gB抗原为包被抗原建立间接ELISA方法:用方阵滴定法确定最佳包被抗原浓度、最佳血清稀释度、包被时间、二抗浓度以及反应时间等。将建立的ELISA分别命名为gB3-ELISA、gB4-ELISA和gB5-ELISA。．

临床样品检测：以IDEXX公司gB-ELISA为对照，用gB3-ELISA、gB4-ELISA和gB5-ELISA检测22份猪血清临床样品，评价3种抗原用于检测猪伪狂犬gB抗体情况。

2结果

2.1克隆、鉴定及测序

gB基因各片段扩增产物经琼脂糖电泳显示，分别可见约1330bp、700bp、620bp和600bp的4个基因片段（见图1），大小与gB基因相符，预测证实所克隆的基因完全正确。

2.2重组表达质粒的鉴定

4种重组表达质粒经EcoRI和SalI双酶切，分别可见约1330bp、700bp、620bp和600bp的目的基因片段。见图2。测序结果于预期相符。

2.3重组蛋白的表达与纯化

IPTG诱导4h的破菌沉淀和上清经SDS-PAGE分析，分别在75、51.9、49和48.7×103Da处出现目的条带（图3）。与gB-1、gB-3、gB-4和gB-5的理论分子量相符。4种融合蛋白主要以包涵体形式存在。薄层扫描分析显示:gB-3、gB-4和gB-5的表达量较高，约占菌体总蛋白30%、35%和39%。gB-1的表达量较低仅占菌体总蛋白的10%（图略）。

注：1未诱导菌；2pGEX-6P-gB-3诱导菌；3pGEX-6P-gB-4诱导菌；4pGEX-6P-gB-5诱导菌；5低分子量蛋白Marker；6pGEX-6P-gB-3纯化蛋白；7pGEX-6P-gB-4纯化蛋白；8pGEX-6P-gB-5纯化蛋白Note:1:Controlwithoutinduction；2:ExpressionsofpGEX-6P-gB-3；3:ExpressionsofpGEX-6P-gB-4；4:ExpressionsofpGEX-6P-gB-5；5:Lowmolecularweightproteinmarker；6:PurfiedproteinofpGEX-6P-gB-3；7:PurfiedproteinofpGEX-6P-gB-4；8:PurfiedproteinofpGEX-6P-gB-5

2.4Westernblotting鉴定

用PRV阳性血清作一抗，抗猪IgG的抗体为二抗。分别对菌体蛋白和纯化蛋白进行Westernblotting鉴定。结果表明，4种蛋白均可与阳性血反应（图4），由于gB-1表达量不高，难以纯化。对表达的gB-3、gB-4和gB-5进行了纯化和鉴定。其中图4-A为未纯化的蛋白与阳性血清鉴定结果，图4-B为纯化蛋白鉴定结果。图4-A显示4种重组蛋白均可与阳性血清反应，gB-1由于蛋白量低，阳性带隐约可见，其他条带比较清楚。

2.5ELISA检测

用初步建立的间接ELISA方法与IDEXX公司的gB-ELISA试剂盒同时检测22份临床猪血清样品。结果显示，以gB-3，gB-4，gB-5为抗原建立的间接IELISA方法和IDEXX公司的gB-ELISA方法的符合率分别为40.9%（9/22）、81.8%（18/22）和81.8%（18/22）。具体见表1。

3讨论

本研究依据gB蛋白有多个B细胞抗原决定簇的特点，设计4对特异性引物，扩增含不同抗原决定簇的基因片段进行分段表达。寻找抗原性好的蛋白，用来制作gB抗体检测试剂盒。结果显示，表达的4种重组蛋白均能与PRV阳性血清反应。其中gB-1表达量较低，gB-3，gB-4和gB-5表达量较高。

国外学者对gB的生物学功能进行了大量研究。Favoreel等发现gB和gD共同诱导机体产生的抗体能引起酪氨酸磷酸化依赖信号转换途径的激活，从而导致细胞内吞作用。另有研究发现，gB还能调节PRV的传播，在神经元-细胞连接点病毒单独释放时，由gB/gH/gL组成的融合复合体通过附近并列的薄膜进入轴突连接的细胞。以gB构建的DNA疫苗可以诱导猪体的细胞免疫，并且在早期感染时能够减少病毒的排泄。用杆状病毒表达gB蛋白免疫鼠收集的抗体可以在体外中和PRV，并且免疫鼠能抵抗PRV致死性攻击。用杆状病毒系统表达的gB蛋白建立夹心ELISA方法，能检测感染PRV7d的猪血清中的gB抗体，也可检测未感染小猪血清中的母源抗体。

我国主要免疫PRVgE缺失疫苗预防猪伪狂犬病，以检测gE抗体来区分PRV免疫和自然感染猪。目前已有商品化的gE和gB抗体ELISA试剂盒出售，在猪伪狂犬病防控中发挥了重要作用。邹浩勇等研究发现gB抗体与中和抗体具有很好的相关性。gB-ELISA试剂盒检测PRV中和抗体阳性血清，可检测97.8%的阳性率；而gE-ELISA试剂盒只能检出34.6%的阳性率。因此，检测猪血清中的gB抗体可用于疫苗免疫效果评估。

本研究表明，用大肠杆菌表达的不同片段的gB抗原均能与猪伪狂犬阳性血清反应。以gB-4和gB-5重组抗原建立的ELISA方法与IDEXX公司的gBELISA试剂盒符合率均为81.8%。但是限于检测样品的数量较少，抗原评价可能存在差异。仍需扩大检测样品数量，进一步评估鉴定。

4小结

首次成功对gB基因进行了分段表达，表达的重组蛋白均能被PRV阳性血清识别。其中gB-4和gB-5具有较好的抗原活性，适用于猪伪狂犬gB抗体检测试剂盒的进一步研究。