猪捷申病毒检测方法研究进展

猪捷申病（Porcineteschen disease，PTD）是由小RNA病毒科捷申病毒属的猪捷申病毒（Porcine teschovirus，PTV）引起的以猪脑脊髓灰质炎、母猪繁殖障碍、肺炎、下痢、心包炎、心肌炎、皮肤损伤及无症状等为主要表现的一种病毒性传染病。该病于1929年首次发现于捷克斯洛伐克的捷申地区，所以又称“捷申病”，各年龄阶段的猪均易感，并具有很高的病死率（90%以上）。20世纪50年代，英国发生类似疾病，但猪群病死率相对较低，从感染猪体内分离到的毒株命名为Talfan，后发现引起此次疫情的Talfan毒株与Teschen毒株均属于猪捷申病毒的血清1型（PTV-1型）。后来由毒力较弱的毒株引起的温和型脑脊髓炎也称为“塔番病”，又称“塔法病”或“塔尔凡病”（Talfan disease）。猪捷申病主要流行于欧洲，随后流传至北美、非洲、澳大利亚和日本等国。2003年，我国哈尔滨兽医研究所研究人员从内蒙古地区某猪场分离到一株猪捷申病毒，证实我国也有该病毒的存在。目前该病已分布到世界各地，给养猪业带来了巨大损失，已成为世界范围内猪的重要传染病之一。PTV共有11个血清型，即PTV-1型~PTV-11型。不同型毒株感染猪群后产生的临床症状也略有不同，严重者可造成猪群的大批量死亡；轻微者也可无明显临床症状。其中由PTV-1型引起的脑脊髓炎被国际兽疫局列为B类传染病，严重阻碍了各国养猪业的发展。近年来，PTV致病力逐渐减弱，未对养猪业造成严重影响，但其潜伏感染仍应引起高度重视。本文就PTV的实验室检测方法研究进展做一综述，以为猪捷申病的诊断和防控提供参考。

1 病毒的分离鉴定

1.1 病毒的细胞培养

病毒分离鉴定是PTV鉴定最为准确、可靠的方法，特别是对新发生本病的地区更为重要。PTV能在猪源细胞如原代、次代的猪肾细胞、PK-15细胞、IBRS-2细胞，ST细胞等多种细胞上增殖并产生细胞病变（cytopathic effect，CPE）。不同毒株所产生的CPE不同，主要表现为细胞呈圆形，葡萄样聚集破碎、脱落；细胞内颗粒增多，周围呈星状突起等。发病早期，采集病猪脑组织、脊髓、肝脏、脾脏、大肠和小肠、淋巴、肾上腺、胸腺以及粪便、分泌物等组织脏器通过研磨制成组织悬液，离心取上清，过滤除菌后接种到PK-15细胞等适应PTV生长的细胞上，培养观察细胞病变情况。急性发病猪在脑和脊髓中较易分离到PTV，隐性感染猪主要粪便、肠、分泌物中分离到病毒。病毒分离往往初代培养的病毒滴度低，细胞病变不明显，因此需盲传几代。培养的细胞可作间接免疫荧光试验鉴定抗原。病毒分离方法虽然可靠，但也存在一定的缺点，如步骤较繁琐，需要长时间观察，不能鉴别血清型等。

1.2 免疫电镜技术

电镜技术用于病毒粒子的鉴定较为直观、灵敏。Feng L等（2007）报道分离的PTV病毒粒子在电镜下呈现直径20纳米的球形粒子，无嚢膜。Cui Shang-jin等（2010）报道分离的PTV8型病毒粒子电镜下呈现直径22~30纳米，核衣壳为20面体对称。免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。主要用于病毒、细菌等抗原定位、免疫性疾病的发病机理及超微结构免疫细胞化学研究等。在标准阳性血清的作用下，可用于PTV与其他引起神经症状的病毒（如狂犬病毒、伪狂犬病毒等）以及同样的小RNA病毒属的其他成员的鉴别诊断。

2 血清学检测

目前用于PTV及其抗体检测的血清学方法有间接免疫荧光试验（IFA）、病毒中和试验（VN）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA）、补体结合试验和免疫组化等，其中应用最广泛的是ELISA和IFA。IFA是用阳性血清中的特异性抗体检测感染细胞中的病毒抗原的一种方法，将异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗球蛋白，用带有UV或蓝光源的显微镜观察，细胞感染PTV12小时后，即在未产生细胞病变时便可检测出抗原。刘芹防等（2011）利用PTV-8 Jilin/2003株为抗原，建立了检测PTV抗体的IFA，敏感性和特异性试验表明该抗原可以检出包含PTV-8型和1型在内的所有PTV阳性血清，方法敏感、特异，与血清中和试验（SN）符合率94.0%。用该方法对黑龙江、山东、天津和河南等地的1500份临床血清样品进行检测，阳性检出率为55.8%，表明我国猪群中PTV的感染已经非常普遍。但该方法一般只能中和特异的血清型，所以存在一定的局限性。因PTV血清型众多，最终的确定还是依靠中和试验。病猪康复的中和抗体至少保持280天，中和滴度1︰64可判为阳性。但由于中和试验较费时、费力，大群检疫多用ELISA。ELISA方法具有敏感性好、操作简单、成本低等优点，是当前动物传染病检疫、流行病学调查和免疫监测等广泛采用的血清学检测技术。国外Hubschile O J B等、Bova T O等已将ELISA用于PTV血清抗体的检测。3D基因是PTV RNA依赖的RNA聚合酶，病毒复制相关抗原，只有在活毒感染的细胞内才能检测到。另外，3D无血清型特异性及高度保守，已成为口蹄疫鉴别诊断过程中的关键蛋白。1996年就有学者应用3D蛋白建立了3D液相阻断夹心ELISA方法，并用于口蹄疫病毒（Foot-and-mouth diseasevirus，FMDV）的检测。由于PTV和FMDV同属小RNA病毒科成员，病毒复制和感染机制极为相似，所以PTV 3D蛋白可以作为鉴别诊断的候选抗原。胡峰等（2012）对PTV-8Jilin/2003株的VP1全长基因进行了表达，并以VP1蛋白为包被抗原建立了间接ELISA方法，非常适合在普通实验室使用，为猪群PTV抗体检测和PTV流行病学调查提供了一种简便的技术手段。但该方法能否较好地检测出其他血清型的PTV抗体还需要进一步的研究。IFA、ELISA和补体结合试验虽然敏感，但容易出现部分血清型的交叉反应。免疫组化作为一种简单、快速的方法应用于PTV的检测。它主通过酶标抗体技术和底物显色，要检测福尔马林固定的石蜡包埋组织中的病毒。免疫组化最主要的优点在于它可以确定病毒在细胞和组织中的具体位置，即进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。普通显微镜下能观察到组织病变与该病原的关系，并确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程，为疾病的确诊提供进一步的依据。Yamada M等（2007）利用免疫组化的方法研究确定了PTV主要抗原在组织、细胞中主要分布位置。免疫组化虽然能确定病毒在细胞和组织中的位置，但不能定量。血清学方法操作步骤比病毒分离简单、省时，但由于PTV血清型众多，不同血清型之间存在交叉反应，影响了血清学检测的敏感性和分型鉴定。

3 分子生物学检测

分子生物学方法是诊断疾病、检测病原最为可靠的方法之一。随着分子生物学的发展以及对病毒基因组结构研究的不断深入，目前已知的PTV毒株基因组序列几乎已全部获得，基于病毒核酸序列发展起来的分子生物学检测方法得到广泛应用。目前PCR技术已广泛应用于PTV的相关研究。PTV具有单股正链RNA，因此建立的RT-PCR方法作为PTV的鉴定发挥着重要的作用，它具有敏感、特异和快速等优点。PalmquistJ M等（2002）利用RT-PCR快速鉴别区分猪脑脊髓炎病毒（Porcine enterovirus，PEV）与PTV；ZellR等（2001），La Rosa G等（2006）利用RT-PCR提出PTV应分为至少11个血清型。从感染PTV的动物体内可以检测到3ABC蛋白抗体、3A蛋白抗体和3C蛋白抗体，而从未感染的动物体内则检测不到，所以用3ABC蛋白进行ELISA是一种比较好检测的方法，该试验可以区分PTV感染抗体和疫苗免疫抗体。李娟等（2007）对中国分离株的3ABC基因进行RT-PCR扩增，获得了3ABC基因的完整序列和NSP-3ABC多聚蛋白的推导氨基酸序列，并进行了核苷酸和氨基酸序列比较，可为捷申病的分子流行病学的研究以及为建立PTV感染动物和疫苗免疫动物的NSP-ELISA检测方法奠定基础，也可为生产中制备鉴别诊断用的抗原提供科学依据。PTV对外界环境的抵抗力较强，可以在猪舍中长期存在，因此容易与猪的其他病毒混合感染，引起感染猪群出现更严重与复杂的临床症状，不利于疾病防控。PTV与猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV-2）共感染可引起感染猪群出现严重的断奶仔猪多系统衰竭综合征临床症状和病理变化。张晓杰等（2012）建立了可同时检测PTV、PCV-2的双重PCR方法。刘杉杉等（2011）建立了同时检测PTV、猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）的多重RT-PCR检测方法。这些方法具有快速、高效、特异性强、敏感性高等特点，从而为检测这多种病毒在猪群中的传播状况提供有效手段，为进一步防控疾病提供有力保障。在PCR基础上发展起来的套式PCR和荧光定量PCR技术，也开始应用于PTV的研究，其在特异性和敏感性上又有一定的提高，对PTV的检测和该病的预防具有重要的作用。Krumbholz A等（2003）建立了PTV的荧光定量RT-PCR，用于早期检测PTV及与肠道病毒的鉴别。胡峰等（2012）为基于PTV 11个血清型基因组5'端非编码区保守序列，设计引物和TaqMan探针，建立了检测PTV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法。但是荧光定量PCR因为对引物的特异性要求高、试验过程中耗材和仪器昂贵以及假阳性现象普遍而受到限制。PTV其他的分子诊断技术的报道较少。

4 存在的问题与展望

猪捷申病是危害养猪业的一类重要传染病。猪是该病毒的唯一宿主。PTV虽然只感染猪，但传播途径多，传播迅速，并且血清型具有多样性，任何年龄猪在感染某一血清型毒株后，还可以再感染其他血清型毒株，所以使捷申病的免疫和诊断变得困难。PTV对外界环境的抵抗力较强，可以在猪舍中长期存在，PTV易与PRRSV、猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）、猪细小病毒（Porcine paruovirus，PPV）、PCV-2、FMDV和CSFV等混合感染，引起感染猪群出现更严重与复杂的临床症状，不利于疾病的防控。虽然PTV具有良好的免疫原性，弱毒株感染能够抵抗强毒攻击，在国外已得到有效控制，但是随着集约化养殖的增多和从欧洲、美洲引种的不断增加，猪捷申病在我国的存在需要引起更多的重视。

在PTV的检测中，近年来研究的侧重点主要是ELISA和PCR，这两种方法以其实用性强、高效、快速、准确而被广泛应用。尤其是PCR检测技术比ELISA法更加敏感，特异性也较强。但是现有的血清学方法无法区分活毒感染和灭活疫苗免疫；PCR和荧光定量PCR检测虽然敏感性和特异性都很好，但易污染且昂贵，对仪器设备等要求很高，特别是荧光定量PCR方法对实验操作人员以及实验条件等的要求较为严格，以及检测成本的限制，因此在推广上仍有很大的限制。在实际工作中，可根据实验室基础条件综合选用合适的检测方法。随着分子生物学的发展和人们对PTV研究的不断深入，相信不久的将来，更多更为高效、敏感、特异、快速、简易而且价廉的检测方法将会被建立起来。