一起猪链球菌病的临床分离鉴定及诊治

猪链球菌病是由感染溶血性链球菌引起的，此病发病急、病程短、死亡率高，各种年龄和品种的猪都可以发病，临床上常表现为猪急性败血症、脑膜炎、肺炎、淋巴结脓肿、慢性关节炎及心内膜炎等，已成为养猪生产中的常见病和多发病，对养猪业危害很大。

某自繁自养猪场内保育猪出现散发的关节肿大和跛脚症状，少数病猪可见倒地抽搐，口吐带血色的泡沫，四肢呈划水状，病程较长者表现消瘦，精神沉郁，患病猪初期体温升高达4l-42℃，食欲废绝，站立困难。出现临床症状后2d内有死亡现象，发病率约为6%，

不用药物治疗的情况下死亡率可达50%。剖检发现，主要病理变化是以各脏器出血、充血为特征的败血症。喉头、淋巴结、肺等器官出血或者充血，气管、肺内充满泡沫；脑膜有不同程度充血、出血；关节囊内有黄色胶冻样或纤维素性脓性渗出物；心包、胸腔、腹腔有纤维素性渗出物。笔者采集病料后，进行了病原的分离鉴定与药敏试验，并选用敏感药物进行临床治疗，取得了良好的防控效果，现将诊治方法报道如下。

一、材料与方法

1、材料

无菌采集该猪场病死猪心脏、肺脏、大脑等组织进行实验室检测。微量生化鉴定管和药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)购自于海博生物，胰蛋白大豆肉汤TSB购自北京希凯创新科技有限公司，TaqDNA Polymerase dNTPs、Trans 2K DNA Marker均购自北京全式金生物有限公司，其它常规试剂均为分析纯。小白鼠购自江西医学院实验动物中心。

2、细菌分离培养

将无菌采集的死亡猪心脏、肺脏、大脑病料分别接种子含5%小牛血清的TSA平板和10%兔血琼脂平板，37℃烛缸培养24h；观察菌落形态、溶血性以及单个菌落的革兰氏染色镜检结果。对疑似猪链球菌的菌落挑出接种到新的TSA平板上纯化培养。

3、生化试验

用接种环将TSA培养基上生长纯化的细菌接种到生化微量发酵管中，37℃条件下培养24h后观察结果。生化试验参考《常见细菌系统鉴定手册》翻提出的方案。

4、分离菌株PCR鉴定

参照文献设计猪链球菌16SrRNA引物。上游引物Pl:5'-GCAGCGTArITCTGTCAAACG-3'，下游引物P2:5'-CCATGGACAGATAAAGATGG-3'，扩增片段理论长度为688bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。采用煮沸方法提取细菌DNA模板。反应体系(25uL体系)：l0×PCRBuffer2.5u.L，dNTPs(10umol/L)1uL，上游引物(10pmol/uL)1uL，下游引物(10pmol/uL)1uL，TaqDNA聚合酶(5U/puL)0.25uL，DNA模板luL，ddH2018.25uL。反应条件：94℃预变性5min;94℃45s，57℃45s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

5、动物试验

将小白鼠随机分为3组，2组试验组，1组对照组，每组5只。试验前小白鼠均饲养3d以证实健康方可使用。试验组和对照组小白鼠腹腔分别接种分离菌血清肉汤培养物和血清肉汤，皆为0.2mL。应用平板稀释法计数，每只小鼠腹腔接种2xl08CFU。隔离饲养观察，对死亡小鼠进行回归试验。

6、药敏试验

按K-B药敏纸片的方法，选用14种常见药物对分离菌株进行药敏试验。

二、结果

1、细菌分离结果

分离菌在TSA平板上分离到形态、大小比较一致的2株细菌，菌落直径为0.5—1.0mm，呈半透明、表面光滑、圆形、边缘整齐，且该菌为兼性厌氧菌，在兔血琼脂平板都呈现B溶血的灰白色细小菌落；革兰氏染色为阳性，菌体呈圆形，多呈双球形或短链状，液体培养物中链较长，一般由8—15个球菌排成链状。

2、生化鉴定结果

从生化鉴定管的结果看，该两株菌能分解半乳糖、麦芽糖、果糖和葡萄糖，不分解山梨醇、甘露醇；吲哚、甲基红、赖氨酸阳性，鸟氨酸、触酶试验阴性，不产硫化氢。分离菌生化特性试验结果见表l，符合链球菌的生化鉴定特征。

3、PCR鉴定结果

猪链球菌疑似菌株经PCR反应得到的目的条带大小为688bp，与预期片段大小一致（图1），进一步证明分离菌为猪链球菌。

4、动物试验结果

试验组小白鼠2d内全部死亡，对照组未见异常。采取死亡小鼠的心脏、肝脏和肺脏进行细菌分离，可重新分离到上述2株细菌。结果表明分离菌株具有较强的致病性。

5、药敏试验结果

利用分离到的2株猪链球菌进行药敏试验，结果见表2。药敏试验结果表明，两株猪链球菌对头孢唑啉、阿莫西林、头孢曲松、头孢拉定、氟苯尼考、青霉素G、氯霉素高度敏感，而对强力霉素、恩诺沙星、左氧氟沙星、大观霉素、阿奇霉素中度敏感，对林可霉素、磺胺异Ⅱ恶唑耐药。

三、防治措施

1、根据病原诊断结果结合猪场的具体情况制订防治措施如下：

1）对有临床症状的猪进行隔离治疗，根据药敏试验结果选用高敏药物头孢唑啉钠注射液30mg/kg体重肌肉注射，每天2次，连用3d；全群每吨水中添加20%头孢400g、电解质多维1kg、葡萄糖3kg，连用7d。

2）加强猪场日常的饲养管理，保持环境清洁、干燥通风，猪舍使用2%烧碱水溶液彻底消毒，粪便采用堆积发酵处理消灭病菌。

3）病情稳定后全群猪接种猪链球菌2型灭活疫苗，种用公猪、母猪、架子猪每头每次肌肉注射不少于2mL，断奶仔猪1.5mL，免疫2周后再同剂量加强免疫1次。

2、经过上述处理，除少量发病比较严重的猪只死亡外，再无新病例发生，病猪食欲增加，病情得到控制，1周后猪群逐渐恢复正常。

四、讨论

根据猪场发病情况、临床症状、病原分离培养、生化试验、PCR鉴定与防治效果的综合分析，可以确诊本次发病为猪链球菌病。本研究选择了兽医临床上常用的几种药物对分离的病原菌进行药敏试验，结果显示，该场猪链球菌对头孢唑啉、阿莫西林、头孢曲松、头孢拉定、氟苯尼考、青霉素G、氯霉素高度敏感。临床治疗用药应避免盲目，应在药敏试验指导下进行。

贯彻以防为主的方针，加强饲养管理，搞好环境卫生和消毒。无论是规模化养猪场还是农村散养户，都要搞好饲养管理，坚持自繁自养和全进全出的原则；保证猪群充足的营养，减少应激；搞好猪舍环境卫生，保持良好的通风和适宜的温度、湿度；定期消毒，交替使用消毒药，防止耐药菌株的产生；控制人员和物品的流动；同时做好其他疫病的防治工作。