精液保护剂对猪卵母细胞和精子及胚胎发育的影响

（1．河北农业大学动物科技学院，河北保定 071001；2．中国农业大学动物科技学院，北京 100094；3.北京安伯胚胎生物技术中心，北京 100107）

摘要：本研究探讨了靓精对猪卵母细胞体外成熟和孤雌及体外受精后早期胚胎发育的影响，以确定其对猪卵母细胞及精子的影响。实验结果表明靓精不会危害卵母细胞的成熟、后期发育及精子质量。

关键词：猪；卵母细胞；精子；靓精

The effect of Liangjing to pig oocytes and sperm and embryonic development

Chen Danshuo1, Zhang Zhennan1, Wang Xiaodong2, Zhang Zhenni2,

Wang Shumin2, An Lei2, Tian Jianhui2*

(1.Agricultural University of Hebei College of Animal Science and Technology, Baoding 071001,China;2.China Agricultural University College Animal Science & Technology, Beijing 100094,China;3.Beijing Anbo Embryo Biotech Center, Beijing, 100107,China)

Abstract:This study investigatedthe effects of Liangjingon pigoocytesmaturationandin vitro fertilizationandparthenogeneticembryonic development, in order to determine its effect onporcine oocytesandsperm. The experimental results show thatLiangjingdoes notharmoocytesmaturationandlatedevelopment, and also won'treducethe quality of sperm.

Key words: Pig; Oocytes ; Sperm; Liangjing

养猪业是关系国民生计的产业，随着集约化养殖发展模式的普及，在规模化猪场推广人工受精技术可以显著提高养猪业的经济效益。而猪精液的保存时间及受精能力则是提高效益的关键环节。精液保护剂可以提高精液受精能力，延长精液有效保存时间[1]，从而提高种公猪利用效率，减少种公猪饲养数目，降低生产成本，提高效益。因此开发一种不伤害卵母细胞和精子，又能提高精子保存时间和受精能力的精液保护剂就很必要。

靓精是由公司开发的一种提高精子精子保存时间及受精能力的药物，其主要成分为聚维酮碘（PVP-I）。聚维酮碘为碘伏的一种，是表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）与碘的复合物[2]。聚维酮碘对真菌、病毒和革兰氏阴阳性菌都具有杀死作用[3-4]。

本实验通过对病原抑制实验筛选出三个靓精浓度，将靓精分别添加到成熟培养液M199、孤雌化学辅助培养液（含CB和CHX的PZM-3）及精子稀释液中，研究靓精对于卵母细胞的成熟、后期发育、精子活力及受精能力等的影响。

猪的卵巢取自某某屠宰场，将离体的卵巢及时放入装有含双抗（青霉素和链霉素，各1000IU/ml）的37℃生理盐水的保温瓶中，3h内运回实验室。

猪的精液取自北京中顺景盛种猪改良有限公司。

以上溶液均用0.2 μm滤器过滤，4℃保存。

将取回的卵巢用含双抗的灭菌生理盐水清洗三次，放入38℃的水浴锅中，使用20 ml的注射器从卵巢表面上直径为3-6毫米的卵泡中抽取卵丘卵母细胞复合体（COCs），将抽取液放于15 ml离心管中，38℃水浴静置至完全沉淀，洗卵液TL清洗两次，显微镜下捡取包裹有三层以上卵丘细胞的COCs。

将挑选好的卵母细胞移入覆盖有矿物油且预先平衡2h以上的M199中洗三次，再移入覆盖矿物油且平衡好的M199滴中，每滴60 μl，放入20-15个卵母细胞，培养48 h，培养条件为5%CO2的空气，38. 5 ℃及100%相对饱和湿度。

将脱去卵丘的成熟卵母细胞，先用事先预热的融合/激活液洗涤3遍，之后将其转移到已经铺满激活液的融合槽中，施加电脉冲进行电激活，之后放入平衡2 h以上含CB和CHX的PZM-3培养滴中洗三次，在放入相同溶液的培养滴中进行化学辅助激活，4 h后移出并用PZM3 培养液洗涤3遍，转移到矿物油覆盖并预先在 5%CO2培养箱中平衡至少2 h以上的PZM3 发育液滴中继续培养。38.5℃，5%CO2，饱和湿度下培养48 h和168 h分别记录卵裂和囊胚形成结果。

实验前一天取回精液后，首先取出2 ml放入管中，并置于37 ℃水浴锅中，20-30 min后检测精子活力和密度，精液于17 ℃恒温箱中保存。实验当天，取10 ml精液加入离心管中，1000 r•min-1离心5 min，弃上清，加入预热的PBS-BSA洗一次，1000 r•min-1离心5 min，弃上清，将沉淀吸出放入含有获能液的离心管中，呈45°放入培养箱获能，30 min后取出检测精子活力及密度。

将成熟好的COCs脱去颗粒后放入受精液滴中，每滴50 μl，放入15-20个卵母细胞，然后放入50 μl获能的精液。放入5% CO2，38. 5℃及100%相对饱和湿度的培养箱中受精，6 h后将卵母细胞移入平衡4 h以上的胚胎培养液中洗去精子，再换入新的胚胎培养液中培养。38.5 ℃，5%CO2，饱和湿度下培养48 h和168 h分别记录卵裂和囊胚形成结果。

成熟44 h的卵母细胞在透明质酸酶中脱去颗粒细胞，放入4%PFA中固定45 min，然后在含0.1%PVA的PBS中洗三次，每次5 min，接着使用DAPI染色，5 min后压片，观察结果，以排出第一极体认为成熟。

使用TUNEL试剂盒染色。囊胚先于含0.5%Triton的4%PFA中固定通透，37 ℃，45 min；染色液为试剂一（Label）和试剂二（Enzyme）以9:1的体积比混合，固定好的囊胚在含0.1%PVA的PBS中洗三次，每次5 min，接着在染色液中染色1 h，PBS-PVA洗三次，最后DAPI染色，5-10 min。

使用计算机辅助精液分析（CASA）进行精液检测。采精后6 h进行首次检测，之后每12 h检测一次。

数据结果用平均数±标准差表示，利用 SPSS 20.0 中 One Way－ANOVA过程对数据进行分析处理。

实验共分四组，成熟液中靓精添加浓度分别为0.5%、0.75%和1%，以及正常成熟液作为对照组。卵母细胞在含有不同浓度靓精及正常培养液中成熟培养1小时后全部移入正常成熟培养液，对成熟44 h卵母细胞进行DAPI染色和孤雌激活分别观察成熟率及卵母细胞后期发育能力。

结果如表1和表2所示，添加靓精培养组卵母细胞成熟率与对照组间没有显著差异。同时对后期发育结果统计发现所有组间卵裂率和囊胚率都没有显著差异，然后对囊胚进行TUNEL染色统计囊胚总细胞数和凋亡细胞数，均未发现显著差异。

表1 M199中添加靓精对卵母细胞成熟率的影响

组别

重复次数

培养卵数

成熟卵数

成熟率(%±SD)

对照

3

113

86

76.11±3.73

0.5%

3

119

94

78.99±5.01

0.75%

3

113

88

77.88±3.64

1%

3

117

90

76.92±3.44

注：组间没有显著差异（P<0.05）。

表2 M199中添加靓精对卵母细胞孤雌后发育能力的影响

组别

重复次数

孤雌卵数

卵裂率（%±SD）

囊胚率（%±SD）

囊胚细胞数

凋亡细胞数

对照

5

249

168(67.46±2.21)

85(34.08±3.1)

69±1.73

2.37±0.19

0.5%

5

243

157(64.61±1.62)

79(32.62±0.8)

68.09±1.26

2.56±0.24

0.75%

5

264

173(65.53±1.82)

97(36.81±1.4)

67.72±1.25

2.69±0.17

1%

5

264

164(62.12±2.12)

79(29.86±1.3)

66.25±1.37

2.5±0.14

注：组间没有显著差异（P<0.05）。

卵母细胞电激活后，放入含有靓精和正常的化学辅助激活药物的培养液滴中，4 h后全部换至正常胚胎培养液中培养。

结果显示对照组的卵裂率（61.22%）和囊胚率（35.54%）与添加靓精的实验组间均无显著差异，四组囊胚染色后总细胞数和凋亡细胞数间同样没有显著差异（表3）。

表3 PZM-3中添加靓精对卵母细胞孤雌后期发育的影响

组别

重复次数

孤雌卵数

卵裂率（%±SD）

囊胚率（%±SD）

囊胚细胞数

凋亡细胞数

对照

5

228

139(61.22±2.4)

81(35.54±1.1)

67.08±2.3

1.78±0.1

0.5%

5

244

146(59.95±2.1)

80(33.02±1.2)

65.23±1.1

2.29±0.14

0.75%

5

237

140(59.19±1.9)

88(36.98±0.8)

68.39±1.6

2.03±0.16

1%

5

241

135(56.15±0.4)

75(31.34±2.6)

64.08±0.8

2.38±0.13

注：组间没有显著差异（P<0.05）。

精液稀释液是将采集到的公猪原精液进行稀释时所用的人工配制化学制剂。精液稀释液中添加不同浓度靓精，6 h进行首次检测，之后间隔12 h检测一次。从表4中可以发现在30 h时0.75%组的直线运动精子活率显著高于1%组，而与其他两组间无显著差异。42 h时0.75%组的精子活率显著高于对照组，而与0.5%及1%两组间没有显著差异；并且0.75%组的A+B级精子比例显著高于对照组和0.5%组；而0.75%组的直线运动精子活率显著高于其他三组。

精子经添加不同浓度靓精的精液稀释液稀释后放置一天，用于体外受精。

结果如表5所示，含不同浓度靓精的精液稀释液稀释的精液用于体外受精后，观察结果发现对照组卵裂率（61.08%）和囊胚率（21.62%）与其他三组间没有显著差异；进一步进行囊胚凋亡染色，发现囊胚细胞数和凋亡细胞数间也都没有显著差异。

表4 精子稀释液中添加靓精对精子的影响

时间

组别

重复次数

检测项目

精子活率（%）

A+B

（%）

直线运动精子活率

（%）

VCL

（μm/s）

VSL

（μm/s）

ALH（μm/s）

LIN

（%）

6h

C

6

83.52±3.34

78.90±5.11

45.99±10.29

36.30±3.02

24.92±2.43

4.15±0.05

68.76±5.42

0.5%

6

85.50±5.88

79.18±10.30

52.74±4.05

34.82±6.46

23.38±4.85

4.14±0.04

67.07±4.65

0.75%

6

84.83±4.95

79.43±9.95

52.70±5.22

36.34±4.18

22.97±5.21

4.10±0.08

62.70±8.62

1%

6

80.91±3.68

74.17±6.23

50.12±3.90

39.03±4.62

25.10±3.15

4.11±0.03

64.31±3.63

18h

C

6

72.86±4.16

62.64±9.87

37.20±7.23

35.84±4.48

21.95±4.17

4.08±0.08

61.12±8.48

0.5%

6

77.12±5.95

67.82±11.89

40.56±8.22

40.68±4.86

23.94±4.17

4.06±0.05

58.69±6.03

0.75%

6

76.32±3.93

70.82±6.02

42.19±6.35

38.48±7.39

22.86±7.58

4.06±0.07

58.22±8.15

1%

6

77.34±5.39

69.15±8.46

38.61±5.42

34.06±5.97

22.43±6.13

4.07±0.13

59.15±14.99

30h

C

6

65.61±10.49

56.23±9.74

29.06±6.55ab

37.59±3.88

22.24±3.61

4.06±0.05

59.01±5.83

0.5%

6

73.41±6.16

65.77±10.79

29.69±3.13ab

37.86±3.45

23.08±5.00

4.08±0.10

60.65±10.84

0.75%

6

73.42±2.29

64.87±5.40

33.20±6.47a

37.05±7.30

22.42±6.14

4.07±0.05

59.78±5.70

1%

6

67.99±6.44

60.70±8.47

25.30±2.84b

35.96±4.25

21.98±4.60

4.08±0.10

60.35±11.08

42h

C

6

60.62±6.47a

49.67±9.23a

21.95±5.37a

32.85±2.99

18.85±2.97

4.05±0.06

57.29±6.65

0.5%

6

64.47±5.48ab

50.67±6.61a

24.35±5.32a

32.58±3.36

20.82±3.21

4.11±0.05

63.71±5.61

0.75%

6

71.05±2.08b

62.63±7.93b

30.21±4.82b

31.40±4.66

17.77±4.80

4.04±0.08

55.94±8.92

1%

6

64.51±1.94ab

56.45±6.40ab

20.85±3.63a

34.01±5.16

19.53±3.57

4.05±0.07

57.60±8.26

注：同时间同列数据肩标的不同字母表示差异显著（P<0.05）。A+B表示根据精子运动速度所得快速前向运动精子（A级）和慢速或呆滞前向运动精子（B级）的比例之和。平均曲线运动速度（Curvilinear velocity，VCL）：即精子头部沿其实际行走曲线运动的速度。平均直线运动速度（Straight line velocity，VSL）：也称前向运动速度，即精子头部直线移动距离的速度。精子平均侧摆幅度（Amplitude of lateral head displacement，ALH）：精子头实际运动轨迹对平均路径的侧摆幅度。运动的直线性（Linearity，LIN）：也称线性度，即精子运动曲线的直线分离度，即 VSL/VCL。

表5 精子稀释液中添加靓精对IVF的影响

组别

重复次数

受精卵数

卵裂率（%±SD）

囊胚率（%±SD）

囊胚细胞数

凋亡细胞数

对照

4

167

102(61.08±2.9)

36(21.62±1.3)

55.06±1.1

1.86±0.08

0.5%

4

165

102(61.82±1.4)

38(22.89±0.9)

50.90±1.9

1.80±0.13

0.75%

4

165

105(63.64±0.9)

38(23.12±1.5)

56.56±2.0

2.09±0.11

1%

4

164

98(59.76±1.4)

33(20.12±1.8)

48.99±1.2

2.33±0.17

注：组间没有显著差异（P<0.05）。

我国是世界养猪大国，猪业在中国农业产业经济中占据主导地位，并且是一个具有坚强生命力的长青产业。2014年中国的生猪年末存栏为46583万头、出栏量达73510万头[5]。近十年来养猪业发生巨大变化，在一定程度上中国生猪产业将整体进入微利时代，因此迫切需要一些方法降低生产成本提高效益，而精液保护剂正符合这一要求。

聚维酮碘属卤素类消毒剂对革兰氏阴性、阳性菌、真菌和病毒具有广谱杀灭作用。研究表明PVP-I对于常见的肠道杆菌、革兰氏阴性杆菌、芽孢、病毒、螺旋体、革兰阳性球菌等微生物均有良好的杀灭效果，且很少出现耐药性反应[3-4]。

每毫升猪鲜精中通常含有104-105个细菌，可能影响精液的保存时间[6]。在被感染的猪精液中发现的许多病毒被报道与不孕或降低繁殖力相关[7]。

本实验中研究的药物靓精的主要成分就是聚维酮碘，要检测靓精对精子的作用的首要任务就是确定靓精对于卵母细胞的成熟及后期胚胎发育能力是否会有危害作用。

研究表明猪卵母细胞的成熟质量会影响到其受精或孤雌后的胚胎发育能力，而排出第一极体可作为猪卵母细胞成熟的标志[8]。本实验中成熟率的统计就是通过对成熟培养44 h后的卵母细胞进行DAPI染色观察第一极体的排出率而得出的。并且研究了卵母细胞在含不同浓度靓精的成熟培养液中培养1h后，再恢复正常成熟培养的成熟率与对照组的成熟率（76.11%）间没有显著差异，这说明靓精在卵母细胞的成熟阶段不会有阻碍作用。同时观察到无论是在成熟培养液中还是在胚胎培养液中添加靓精胚胎的卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数、凋亡细胞数在各组间都没有显著差异，结合这些结果表明靓精不会危害卵母细胞的成熟及其后续发育能力。

影响精液质量及精子活率的因素很多，主要有温度、稀释液pH值和成分[9]。本实验中添加靓精至精液稀释液中，使用计算机辅助精液分析系统（CASA）检测精子指标，如精子活率、A级+B级精子比例、直线运动精子比例、平均曲线运动速度（Curvilinear velocity，VCL）、平均直线运动速度（Straight line velocity，VSL）、精子平均侧摆幅度（Amplitude of lateral head displacement，ALH）以及运动的直线性（Linearity，LIN）等[10]。通过实验结果发现，当精液保存一定时间时，靓精添加浓度为0.75%的实验组的精子活率和直线运动性比其他组效果都好。接着又通过体外受精比较了胚胎卵裂率与囊胚率，但各组间均未发现显著差异。

为检测靓精是否对卵母细胞及精子有毒害作用，本实验在卵母细胞成熟液、胚胎培养液和精子稀释液中添加靓精观察卵裂率、囊胚率、囊胚总细胞数及凋亡细胞数。结果显示添加靓精的实验组的所有指标与对照组间均无显著差异，这表明靓精不会危害卵母细胞的成熟及后期发育，并且精液稀释液中靓精浓度为0.75%时，精子的保存效果更好。但是靓精对于精子受精能力的影响还需进一步实验。

[1] 冯晓巍.聚维酮高络合碘溶液体外杀灭猪精液中病原微生物活性研究及其对猪精液品质和常温保存的影响[D].南京农业大学, 2013.

[2] Martindale. The Extra Pharmacopoeia [M]. 31 ed. 1996: 1144

[3] 张朝武.碘伏对腊状杆菌芽孢杀灭机理的研究[J].中国消毒学杂志,1991,8(2):69

[4] 蒋朱明.PVP-I作皮肤灭菌的临床评价[J].中华外科杂志,1986,24(5):288

[5] 陈瑶生，王健，刘小红.中国生猪产业新趋势[J].中国畜牧杂志, 2015, 51(2):8-14.

[6] 包宋权，梁世忠，韦明宇.聚维酮碘对常温保存猪精子质量的影响[J].中国兽医学报, 2011, 31(1):118-124.

[7] D. Maes，H. Nauwynck，T. Rijsselaere.Diseases in swine transmitted by artificial insemination: An overview[J].Theriogenology, 2008, 70(8):1337-1345.

[8] 卢晟盛,张明,黎宗强.不同成熟液对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后早期胚胎发育的影响[J].广西农业生物科学, 2003, 22(4):297-301.

[9] 高建明,虞桂平,邵世义,等. 不同稀释液对猪精液常温保存效果的影响[J]. 中国畜牧杂志，2007（13）:12-14．

[10] J.C.Lu,Y.F.Huang,N.Q.Lu. Computer-aided sperm analysis: past, present and future [J].Andrologia, 2014(46):329-228.

作者简介：陈丹朔（1988-），女，硕士，胚胎工程，chdsh0412@163.com

通讯作者：田见晖（1968-），男，教授，胚胎工程，tianjh@cau.edu.cn

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