传染性胃肠炎是由传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)所引起的以严重腹泻、呕吐、脱水和高死亡率为主要特征的高度接触性传染病,尤其以2周龄以内仔猪的发病率和死亡率最高,致死率可达100%,对发生该病的猪场造成严重的经济损失。由于当前商业化的疫苗不能够给仔猪提供良好的免疫保护,开发一种对猪安全、有效并能迅速产生免疫力的新型疫苗势在必行。TGEVS蛋白中的A、D抗原位点在诱导中和抗体中起主要作用,而且A抗原位点又是一个主要的B细胞抗原表位；N蛋白中的N321位点是TGEV中最主要的T细胞抗原表位,能诱导T细胞在体内协助合成中和抗体即抗S蛋白的特异性抗体,因而在构建疫苗时需考虑的一个主要问题是如何利用并加强TGEV中这些主要抗原位点的有效表达。在本研究中,我们将上述的三个抗原表位基因连接在一起并合成后克隆到无抗性原核表达质粒中,通过转化减毒沙门氏菌,成功构建了能有效表达外源抗原的无抗性重组猪霍乱沙门氏菌株,并通过小鼠和仔猪免疫实验,对该重组菌菌株作为猪传染性胃肠炎候选疫苗的免疫原性和保护能力进行了评价。1.重组猪霍乱沙门氏菌的构建及生物学特性的鉴定经过生物信息学分析发现,TGEVS蛋白中A抗原位点是一个主要的B细胞抗原表位,并且在诱导中和抗体的过程中和D抗原位点起着同样重要的作用；而N蛋白中的N321位点是TGEV中最主要的T细胞抗原表位。我们通过使用两个柔性的Linker((GGGGS).),人工合成了一段含有A、D和N321抗原表位基因的重组抗原表位序列(SLN)。在pET-28a载体上,根据(SalI and XhoI)是一对同尾酶的性质将SLN基因进行双拷贝,从而构建出pET-2SLN.然后将SLN和2SLN克隆到非抗性表达质粒pYA3493上构建重组质粒pYA-SLN和pYA-2SLN,进一步电转至沙门氏菌C501构建重组沙门氏菌菌株C501-SLN和C501-2SLN.两株重组菌株在不影响自身生物学特性的情况下,均能高效表达外源抗原；重组菌株回复了能在DAP- LB平板上生长的能力；表型与生化特性研究表明重组菌株C501-SLN和C501-2SLN与亲本株C500相同；外源抗原基因能在重组菌内稳定遗传并持续表达。2.TGE口服疫苗对小鼠免疫效力的研究通过口服免疫小鼠试验,评价重组菌株C501-SLN和C501-2SLN作为TGE口服疫苗的免疫效力。实验结果表明：两株重组菌株都产生了针对沙门氏菌和rSLN高滴度的血清IgG和肠道IgA抗体,而含双拷贝SLN基因的重组菌株C501-2SLN所产生的IgG和IgA抗体水平显著高于含单拷贝SLN基因的重组菌株C501-SLN；另外,含有双SLN拷贝的肽抗原与含有单个拷贝的SLN肽抗原相比,诱导了更高水平的中和抗体水平,这说明重组菌株C501-2SLN是一个更具潜力的中和抗体诱导者；重组菌C501-2SLN在免疫后两周可以检测到抗体滴度相当的IgG2a和IgG1,表明重组沙门氏菌C501-2SLN不仅能诱导黏膜免疫和体液免疫反应,也能诱导一定水平的细胞介导的免疫反应。3.TGE口服疫苗对仔猪免疫保护力的研究1日龄的仔猪口服免疫重组沙门氏菌菌株C501-2SLN(5.3×109CFU)后,在第7天可以在肠道和血清分别中检测到IgA抗体和较低水平的IgG抗体。为评估所诱导产生抗体的保护力,7日龄的仔猪口服1mL TGEV(1×106 TCID50/mL)。结果显示,由沙门氏菌所表达重组表位抗原rSLN能够诱导肠系膜淋巴结发生免疫反应并分泌IgA抗体,后者能够完全保护仔猪抵抗TGEV的侵袭；攻毒后,我们可以在血清和肠道粘液中检测到更高滴度的IgG抗体和IgA抗体。同时,空载体对照组的仔猪(6/6)与PBS对照组的仔猪(6/6)在攻毒后出现了明显的TGE的临床症状并分布在第7天和第6天发生死亡。这说明重组疫苗菌株C501-2SLN在抵抗TGEV感染方面有望成为一种很有潜力的口服疫苗。
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